在臨床診斷、病原體篩查等領(lǐng)域，核酸檢測的快速性、靈敏性與便攜性始終是核心訴求。傳統檢測方法如PCR雖有效，但依賴(lài)專(zhuān)業(yè)儀器，難以滿(mǎn)足現場(chǎng)應用需求。而基于CRISPR-Cas系統的SHERLOCK技術(shù)，通過(guò)創(chuàng )新性結合核酸預擴增與Cas酶的特異性識別，打造出兼具高靈敏度、強特異性與便攜性的核酸檢測平臺，為核酸檢測領(lǐng)域帶來(lái)了突破性變革。

SHERLOCK全稱(chēng)為特異性高靈敏度酶促報告基因解鎖技術(shù)，其核心原理源于Cas13和Cas12酶的"附帶活性"——這些酶在通過(guò)可編程crRNA識別特定目標核酸后，會(huì )激活非特異性核酸內切酶活性，切割旁側的報告分子產(chǎn)生可檢測信號。該技術(shù)通過(guò)四步核心流程實(shí)現核酸檢測：首先制備LwaCas13a蛋白與crRNA等關(guān)鍵試劑，隨后提取樣本中的目標核酸，通過(guò)重組酶聚合酶擴增（RPA）技術(shù)對目標進(jìn)行等溫預擴增并引入T7啟動(dòng)子（Cas12檢測無(wú)需此步驟），最后利用Cas酶的附帶活性切割報告分子，通過(guò)熒光或側向流動(dòng)等方式讀取結果。整個(gè)流程設置時(shí)間不足15分鐘，總檢測時(shí)長(cháng)可控制在1小時(shí)內，高效適配快速檢測需求。

圖 1 | SHERLOCK 實(shí)驗完整工作流程

相較于傳統檢測技術(shù)，SHERLOCK展現出三大核心優(yōu)勢。在檢測性能上，它能實(shí)現單分子級檢測（2 aM濃度），可區分目標序列中的單核苷酸錯配，輕松辨別登革熱病毒與寨卡病毒等相似病原體，甚至能在背景豐度僅0.1%的樣本中檢測到癌癥相關(guān)突變。在實(shí)用性上，該技術(shù)兼容DNA與RNA雙目標檢測，支持熒光檢測、側向流動(dòng)可視化檢測等多種讀數方式，其中側向流動(dòng)檢測無(wú)需專(zhuān)業(yè)儀器，僅需幾分鐘即可通過(guò)肉眼觀(guān)察結果，完美適配資源有限的現場(chǎng)場(chǎng)景。在成本控制上，單重反應成本僅約0.60美元，crRNA合成成本低，酶組件可大規模生產(chǎn)，具備廣泛推廣的經(jīng)濟基礎。

根據實(shí)驗設計的不同，SHERLOCK分為兩步法與一步法兩種形式。兩步法將預擴增與Cas檢測分離進(jìn)行，優(yōu)化難度低、靈敏度更高（可達zeptomolar級別），適合樣本成分復雜的場(chǎng)景；一步法則將所有反應整合在單個(gè)體系中，檢測時(shí)長(cháng)縮短至15-30分鐘，污染風(fēng)險更低，更適合高通量、定量檢測需求。此外，通過(guò)空間多重或光譜多重設計，該技術(shù)可在單個(gè)反應中同時(shí)檢測多達四個(gè)目標，進(jìn)一步拓展了應用場(chǎng)景。

在實(shí)際應用中，SHERLOCK已展現出強大的適配能力。它成功應用于寨卡病毒、登革熱病毒等病原體的現場(chǎng)檢測，可直接從患者尿液、血清樣本中快速篩查，還能區分不同地域來(lái)源的病毒菌株；在基因分型與癌癥檢測領(lǐng)域，其單核苷酸特異性可精準識別循環(huán)游離DNA中的癌癥相關(guān)突變；在農業(yè)與環(huán)境監測中，也能高效檢測病原菌與抗性基因。

盡管優(yōu)勢顯著(zhù)，SHERLOCK仍存在一定局限性，如需專(zhuān)業(yè)知識制備反應組件、缺乏商業(yè)化預設計方案、難以實(shí)現絕對數字定量等，使其在部分常規實(shí)驗室應用中暫無(wú)法完全替代PCR技術(shù)。但隨著(zhù)技術(shù)的持續優(yōu)化，這些問(wèn)題正逐步得到解決。未來(lái)，隨著(zhù)試劑制備的標準化、檢測流程的簡(jiǎn)化以及多重檢測能力的提升，SHERLOCK有望在臨床床旁檢測、突發(fā)疫情防控、基層醫療篩查等領(lǐng)域發(fā)揮更大作用，推動(dòng)核酸檢測技術(shù)邁入便攜化、精準化、低成本的全新階段。