基礎型項目引物篩選邏輯概述

• 收到合成引物后再無(wú)任何陽(yáng)性測試前提下，進(jìn)行全陰性測試，確定陰性條帶。

• 首先以質(zhì)粒高、中濃度為模板，例如可選用1pg/μL和10fg/μL進(jìn)行引物初篩，篩選目的條帶特異明顯、條帶顏色亮、雜帶少且陰性正常（無(wú)非特異性條帶，引物二聚體少）的2-3對引物組合。

• 靈敏度實(shí)驗要求模板做3-4個(gè)濃度，各個(gè)濃度的擴增條帶呈現靈敏度變化，擴增條帶亮度有變化，最終呈現的結果圖要求最低濃度的檢測結果為陰性。最優(yōu)、次優(yōu)引物組合，一般質(zhì)粒靈敏度至少在1fg/μL。

• 將篩到的最優(yōu)、次優(yōu)引物探針進(jìn)行實(shí)際樣本實(shí)驗，比較檢驗樣本的靈敏度，選出目前最優(yōu)的引物探針，一般假病毒的靈敏度是10³-10?copies/mL，根據不同項目靈敏度可能存在差異。

• 注意：凝膠電泳的結果圖最好標注maker大小，目的條帶大小

基礎型項目引物篩選邏輯實(shí)際案例

1、每個(gè)項目建議設計合成3-6條上下游引物用于后續篩選。若篩選引物未符合靈敏度要求，可嘗試在靶標的其他區域進(jìn)行設計合成引物，再次篩選最終得到最優(yōu)引物組合。

2、本實(shí)驗案例在靶標上設計合成3條上游引物，3條下游引物，共9個(gè)引物組合進(jìn)行示范。

Ø引物篩選1—全陰性驗證

• 9組引物組合進(jìn)行全陰性測試，確定陰性正常。

• 在擴增子大小長(cháng)度范圍無(wú)明顯條帶。

Ø引物篩選2（正篩）

• 隨機固定一條上游引物（此實(shí)驗選擇F1），與3條下游引物組合；

• 模板選擇高、中、低濃度測試，選擇條帶明顯、低濃度有擴增的引物組合；

• 引物組合F1+R1與F1+ R3相對較優(yōu)，R1/R3兩條下游引物表現較好；

Ø引物篩選4(靈敏度確認)

• 確定最優(yōu)引物組合F2+ R1后，進(jìn)行初步靈敏度確認；

• 模板濃度的選擇：篩選引物時(shí)能檢出的最低濃度向上/向下選擇1-2個(gè)梯度；

• 最終確認環(huán)節建議加上陰性對照，確認陰性始終正常。

Ø結果討論

• 最優(yōu)引物組合F2/R1，

• 初步判定質(zhì)粒靈敏度0.1fg/uL。

下一步：

 1、客戶(hù)可根據自身項目需求進(jìn)行引物加入量?jì)?yōu)化、反應時(shí)間優(yōu)化等來(lái)提供靈敏度；

 2、特異性交叉驗證實(shí)驗；

 3、收集實(shí)際樣本測試；

 4、與市面上的PCR試劑進(jìn)行靈敏度對比。

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