蛋白質(zhì)芯片是一種高通量的蛋白質(zhì)免疫檢測分析技術(shù)，可以簡(jiǎn)單的理解為多重ELISA檢測技術(shù)。但是不同于ELISA的是，它一次試驗可以檢測幾百種目標因子，且只需10-100ul的樣品。抗體芯片是蛋白質(zhì)芯片中的主要類(lèi)型，抗體芯片是將多種不同的捕獲抗體印制在固相支持物上，每種抗體孤立成點(diǎn)，抗體之間不相互影響，呈方陣排列。最終得到芯片結果圖片，通過(guò)軟件提取圖片熒光值或灰度值，得到芯片數據，根據數據來(lái)比較目標因子信號差異和定量檢測目標因子含量。

蛋白質(zhì)芯片的原理
      蛋白質(zhì)芯片的檢測原理主要是基于抗原抗體特異性非共價(jià)結合。蛋白質(zhì)芯片目前采用的檢測方法主要有雙抗體夾心法檢測和樣品標記法檢測。
      夾心法抗體芯片是將捕獲抗體預先固定在固相載體上，生物樣品加入到芯片上一起孵育反應后， 其特異性的抗原與捕獲抗體結合，然后加入生物素標記的檢測抗體一起孵育，最后通過(guò)HRP-鏈霉親和素與化學(xué)發(fā)光底物、或者熒光染色劑-鏈霉親和素結合作為信號檢測?；?ldquo;三明治”雙抗體夾心法建立的芯片，高品質(zhì)的抗體對是此方法的關(guān)鍵，夾心法有很高的靈敏度，檢測濃度可以低至1-10 pg/mL;每增加檢測一個(gè)蛋白，芯片上就需要增加一個(gè)抗體對， 這樣可能出現交叉反應，因此需要將每個(gè)抗體對與芯片上其他抗體對進(jìn)行檢測，驗證是否可以引入這個(gè)抗體對，且不對其他抗體對檢測造成干擾，通過(guò)優(yōu)化篩選將交叉反應降到最小。
 

蛋白質(zhì)芯片的優(yōu)勢
1.樣品處理簡(jiǎn)單：可以直接用粗生物樣品（血清、血漿、尿、體液等）進(jìn)行分析，只需經(jīng)過(guò)離心處理即可；
2.樣品用量少：可以低至10μl-100μl樣品檢測；
3.高通量：一個(gè)樣品一次試驗可以檢測多種因子(高達成百上千種)，同時(shí)快速的發(fā)現多個(gè)生物標記物，且幾天可以完成上千個(gè)樣品的檢測；
4.特異性和靈敏度高：單克隆抗體芯片特異性高，可鑒定未知抗原/蛋白質(zhì)，以減少測定蛋白質(zhì)序列的工作量，且蛋白芯片的靈敏度高可以發(fā)現低豐度蛋白質(zhì)及生物標志物；
5.可以測定疏水蛋白質(zhì)：與“雙相電泳加質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測定疏水蛋白質(zhì)的表達和功能；
6.集成性：在同一系統中集發(fā)現和檢測為一體；
7.可定量檢測：結合至芯片上的抗體通過(guò)標準曲線(xiàn)來(lái)對測定抗原進(jìn)行定量，但一般飛行質(zhì)譜不用于定量分析；
8.替代和互補傳統檢測方法：利用抗體芯片, 可替代 Western Blot；利用定量抗體芯片，可替代ELISA定量檢測；抗體芯片可以互補流式細胞儀不足的功能，如將細胞溶解，可測定細胞內的抗原，而且靈敏度遠高于流式細胞儀；
9.性?xún)r(jià)比高：利用定量芯片一次性檢測大量目標因子，平均定量每個(gè)因子所需的價(jià)錢(qián)遠比ELISA便宜。


蛋白質(zhì)芯片的分類(lèi)
根據原理：夾心法芯片、標記法芯片、競爭法芯片
根據載體：玻片芯片、膜芯片、96孔板芯片
根據性能：定量芯片和半定量芯片
根據種屬：人類(lèi)抗體芯片、小鼠抗體芯片、大鼠抗體芯片、豬抗體芯片、猴抗體芯片
根據檢測目標：細胞因子（Cytokine) ；抗體芯片凋亡因子（Apoptosis）；抗體芯片肥胖因子（Adipokine)；抗體芯片?血管生成因子（Angiogenesis）；抗體芯片炎癥因子（Inflammation）；抗體芯片動(dòng)脈粥樣硬化抗體芯片（Atherosclerosis）；趨化因子（Chemokine)；生長(cháng)因子（Growth factor）抗體芯片；基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix Metalloproteinase)抗體芯片；白介素（Interleukin)抗體芯片；磷酸化（Phosphorylation）抗體芯片；急性腎損傷(Acute Kidney Injury)抗體芯片


適用于樣品類(lèi)型
血清、血漿、細胞培養上清、細胞裂解液、組織裂解液；
除了這些常見(jiàn)的樣品，全世界客戶(hù)使用RayBiotech抗體芯片產(chǎn)品檢測成功的特殊樣品還有尿液、眼淚、唾液、痰、腦脊液、前列腺液、腹腔注射液、奶水、初乳、支氣管肺泡灌洗液、膿腫液、中耳液、血小板釋放物、骨頭裂解液等。


樣品的收集方法
血清：收集全血至普通離心管或者采血管（BD vacutainer公司的紅頭真空采血管，不含抗凝劑、防腐劑或者分離劑）,4℃放置30-45min, 以3000-5000rpm/min離心10min, 取上清檢測或者凍存（-20或-80℃）。
血漿:收集全血至BD vacutainer公司的EDTAK2、肝素鋰、或者枸櫞酸鈉等真空采血管，以3000-5000rpm/min離心10min, 取上清檢測或者凍存（-20或-80℃）。
尿液：收集不添加穩定劑的尿液樣本，高速離心樣本(如：10000 rpm離心 5min 或5000 rpm離心10 min)，取上清分裝，利用干冰或甲醇浴使樣本迅速結凍，儲存于-80℃備用。
細胞上清（條件培養基）：血清中含有部分細胞因子，所以最好制備無(wú)血清或低血清條件培養基。在第0天,于100mm培養皿中加入完全培養基，然后接種1X106個(gè)細胞，培養第3天，倒掉培養基，加入6-8ml低血清培養基(如含有0.2%牛血清的培養基)；第5天，收集低血清的培養基于15ml離心管中，2000rpm、4℃離心10min，收集上清，分裝于1.5ml EP管中，儲存于-80℃中，可以保存1年以上。不同細胞可根據生長(cháng)狀況確定培養時(shí)間。
 
Q&A
1.半定量和定量芯片的差異？
1）檢測原理和載體的不同：半定量芯片目前有夾心法和標記法半定量芯片，且載體有膜的和玻片的。
定量芯片目前只是采用夾心法，且載體只有玻片。
2）抗體陣列的數量：定量芯片底部沒(méi)有barcode(即白色的條碼),且16個(gè)孔每個(gè)孔都點(diǎn)有抗體陣列，而半定量芯片一般都是上半部分8個(gè)孔點(diǎn)有抗體。
3）抗體重復點(diǎn)：定量芯片每個(gè)點(diǎn)都是4個(gè)重復點(diǎn)，半定量芯片是2個(gè)重復點(diǎn)。
4）檢測性能的差異。
2.膜芯片都有哪些方法對結果進(jìn)行拍照？
1）化學(xué)發(fā)光成像系統拍照；2）膠片曝光成像；3）比色法成像；4）紅外掃描法成像
3.玻片芯片都有哪些儀器可以?huà)呙杞Y果？
一般來(lái)說(shuō)，大多數基因芯片掃描儀都可以使用，只要具有一個(gè)Cy3標記（綠色）通道和≤20μm的像素分辨率，并能夠掃描標準大小的玻片即可。
4.定量芯片試劑盒中玻片的數量，規格，可以檢測幾個(gè)樣品？
一般定量芯片試劑盒的規格有1張，2張，4張玻片的規格；1張玻片上可以做8個(gè)孔的標準曲線(xiàn)，其余8孔可以檢測樣品；對于2張玻片，可以每張玻片都做標準曲線(xiàn)，這樣2張玻片就可以檢測16個(gè)樣品；或者2張玻片同時(shí)操作，保持所有條件一致，可以在第一張玻片上只做一個(gè)標準曲線(xiàn)，從第二張玻片上每張玻片上做一個(gè)空白control和一個(gè)陽(yáng)性質(zhì)控(可選用standard3)其余孔可以用于檢測樣品。


操作步驟



已發(fā)表文獻