超過(guò)90%的新發(fā)結核?。═B）病例發(fā)生在衛生保健基礎設施有限的低收入和中等收入國家?？紤]到基于培養的檢測法需要數周才能獲得最終結果，而基于聚合酶鏈反應（PCR）的方法需要多步工作流程以及昂貴且笨重的設備，因此開(kāi)發(fā)在資源有限的環(huán)境中使用的POC檢測對于改善結核病診斷和治療以及阻止結核病傳播是十分有必要的。傳統的TB篩查的樣本來(lái)源是痰液，僅局限于肺結核（PTB）感染的檢測，而不適用于肺外結核（EPTB）的篩查。此外，痰液檢測對某些少菌性疾病高危人群的診斷作用有限（如幼兒和艾滋病毒感染者），其通常難以產(chǎn)生痰液或產(chǎn)生低負荷細菌的樣本，導致較低的檢測靈敏度?；谏鲜鰡?wèn)題，Tulane大學(xué)醫學(xué)系的Tony Hu團隊在《Science Translational Medicine》上發(fā)表了題為Rapid tuberculosis diagnosis from respiratory or blood samples by a low cost, portable lab-in-tube assay的研究論文。本文報道了一種價(jià)格低廉，手持式電池供電的結核分歧桿菌（Mtb）檢測裝置，可在1小時(shí)內檢測血清、唾液和痰液樣本中檢測多種形式的結核感染。本文通訊作者的研究方向是工程多組學(xué)、納米醫學(xué)、機制驅動(dòng)的生物標志物發(fā)現和檢測方法開(kāi)發(fā)。
02 研究?jì)热?/strong>
本方法包含兩部分裝置，一次性使用的測定管包括測定管外殼、凍干形式的樣品液化試劑（包括裂解緩沖液）、DNA結合膜，以及Mtb DNA檢測所需的凍干形式的RPA和CRISPR-Cas12a組分；便攜式可充電電池供電的測定裝置由觸摸屏控制，包含激光器，熒光成像濾光器，一個(gè)用于讀取檢測結果的攝像頭，以及一個(gè)用于集成熒光成像和自動(dòng)化分析的Raspberry Pi微處理器。
檢測步驟如下，呼吸道樣本首先被收集在測定管中，然后將測定管轉移到便攜式裝置的孵育端口以進(jìn)行滅活和樣本前處理。然后，壓下柱塞將裂解物加載到DNA結合膜上并在該處啟動(dòng)RPA-CRISPR反應。反應完成后，將測定管轉移到分析端口以檢測和分析所得到的熒光信號。檢測時(shí)長(cháng)為1小時(shí)，包含樣本熱裂解、RPA-CRISPR反應以及輸出檢測結果所需的全部步驟耗時(shí)。
對RPA-CRISPR熒光法進(jìn)行了優(yōu)化，考慮到熒光信噪比，選擇Cy5而不是FAM作為探針的熒光基團；根據經(jīng)典的RPA-CRISPR一鍋法原理設計了不含PAM位點(diǎn)的gRNA2和gRNA3用以代替含有PAM的gRNA1，實(shí)現了更快的CRISPR反應速率；凍干RPA-CRISPR試劑后，考察了用于負載的不同材質(zhì)紙基材料的優(yōu)劣，最終選擇孔徑較大的棉質(zhì)紙基材料用以原位凍干RPA-CRISPR相關(guān)試劑。然后細致考察了CRISPR反應最適的條件，使用EnGen LbCas12a時(shí)獲得了較好的反應動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)；在RPA緩沖體系中不添加CRISPR buffer即可獲得最優(yōu)的CRISPR反應速率；最優(yōu)的Cas12a添加量為42 nM，Cas12a與gRNA的比例為1:1。由于全部的試劑都以?xún)龈傻男问奖４?，因此作者考察了不同保護劑的加入對穩定性的影響。結果顯示當保護劑為蔗糖、海藻糖、葡聚糖或甘露醇時(shí)，RPA-CRISPR體系復溶后具有最高的活性；繼續優(yōu)化后發(fā)現僅加入蔗糖一種保護劑的實(shí)驗組即可維持較長(cháng)時(shí)間的穩定儲存，可在室溫存放2個(gè)月或4 ℃以下存放3個(gè)月之久。
接著(zhù)，作者優(yōu)化了裝置設計，考察了不同包覆材料對傳熱效率的影響，以及反應時(shí)測定管自下而上不同高度處的溫度情況，最終選擇導熱效率最高的聚苯乙烯泡沫塑料作為熱傳遞材料。作者羅列了該檢測裝置的構建成本，其中占據主要成本的是光學(xué)元件，為690美金，占整個(gè)檢測裝置的87%；而可拋棄式的測定管僅需2.63美金每反應，因此相比大型檢測儀器具有價(jià)格低廉的優(yōu)勢。
本方法對加標樣本的檢測線(xiàn)性范圍為0.05-5000 pg/μL，還具有較高的特異性和單核苷酸多態(tài)性。在真實(shí)樣本檢測中，本方法的總檢出率為81%（27個(gè)樣本中的22個(gè)），其中肺結核性Mtb的檢出率為83%（18個(gè)樣本中的15個(gè)），肺外結核性Mtb的檢出率為75%（8個(gè)樣本中的6個(gè)）。相對的，傳統痰液或灌洗液培養法對Mtb的檢出率僅為55%（9個(gè)樣本中的5個(gè)），而GeneXpert試劑盒的檢出率也僅有68%（22個(gè)樣本中的15個(gè)）。因此本方法具有較好的臨床Mtb檢出率，在更復雜的肺外感染Mtb案例中也保持了較好的檢測性能。
此外，作者開(kāi)發(fā)了一種基于DTT的樣品前處理方法，針對痰液或血清中粘度較大的蛋白，利用DTT還原這些蛋白之間的二硫鍵，從而降低樣本的粘度，使裂解后的核酸能夠更好的被釋放。結合了樣品前處理后，本方法能夠實(shí)現痰液中78.1 CFU/mL的Mtb檢出，相當于38.2 copies/μL的IS 6110編碼基因或2.4 copies/μL的Mtb基因組。該方法與GeneXpert Ultra的檢測性能在同一數量級（15.6 CFU/mL），優(yōu)于常規型GeneXpert（130 CFU/mL）。
03 研究小結
研究開(kāi)發(fā)了一種用戶(hù)友好的結核桿菌檢測方法，可在1小時(shí)內特異性檢測血液或呼吸道樣本中的Mtb。該方法具有用于樣品孵育、數據采集和結果分析的集成模塊，支持兒童肺結核和肺外結核（基于血清）的結核病診斷和治療監測以及成人的呼吸道樣本分析。適用于利福平耐藥變體Mtb菌株檢測，與現有的診斷技術(shù)相比，該方法具有更高的靈敏度和良好的特異性。然而，該方法仍不符合WHO對POC檢測結核病診斷的最低儲存要求（在5-35 ℃下12個(gè)月，濕度70%），在處理血液樣本時(shí)仍需預分離操作。
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