產(chǎn)品簡(jiǎn)介

enLbCas12a（enhanced LbCas12a）是一種基于野生型LbCas12a核酸內切酶升級改造獲得的高活力LbCas12a突變體。與野生型LbCas12a的作用機制一樣，enLbCas12a也通過(guò)crRNA介導，靶向識別帶有PAM序列（5’-TTN-3’）的雙鏈DNA，使DNA雙鏈斷裂并產(chǎn)生粘性末端。同時(shí)，enLbCas12a對單鏈DNA靶標的識別和剪切不依賴(lài)PAM序列。雙鏈或單鏈DNA靶標均能激活enLbCas12a的反式剪切活性(即旁路剪切活性/附屬剪切活性)，即當enLbCas12a酶與crRNA、靶標DNA結合形成三元復合物后，便會(huì )被激活針對非特異ssDNA序列的反式剪切活性，將體系中的ssDNA序列切碎。因此，enLbCas12a酶不僅可用于體外dsDNA的特異剪切，也可用于靶標核酸的快速檢測。

產(chǎn)品組分

組分	32135-01 (100 pmol)	32135-03 (1,000 pmol)
enLbCas12a Nuclease (10 μM) a	100 pmol	1,000 pmol
10×HOLMES Buffer for Cas12a	1 mL	1 mL

a. enLbCas12a Nuclease濃度為10 μM，即10 pmol/μL；100 pmol規格的總體積為10 μL，1,000 pmol規格的總體積為100 μL；

保存條件

-80℃或-20℃儲存；干冰運輸。

活性定義

在總體積為20 μL的1 × HOLMES Buffer for Cas12a [pH 8.5]反應體系中，37℃反應條件下，1 min內剪切1 pmol ssDNA探針所需的Cas12a酶量定義為1 transU。

例：若某批次enLbCas12a酶的反式切割活性為80.0 transU/pmol，則表明1 pmol的該批次enLbCas12a酶可在1 min內，在上述指定的反應條件下，反式切割80 pmol ssDNA探針。

實(shí)驗流程

1. 順式剪切實(shí)驗

b. 順式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。

若用核酸電泳來(lái)分析順式剪切產(chǎn)物，建議使用dsDNA靶標，因為ssDNA靶標會(huì )被反式激活的Cas12a進(jìn)一步切碎。對于20 μL順式剪切應體系，推薦target DNA的使用量為100 ng～500 ng，且target DNA片段長(cháng)度在300 bp～3 kb范圍內。不同長(cháng)度target DNA需要的Cas酶和crRNA的量需要根據target DNA的摩爾量計算，建議保持Cas酶:crRNA:target DNA的摩爾比為10:10:1，以盡量確保target DNA被剪切完全。

37℃反應30 min ~ 1 h，85℃滅活5 min，核酸電泳分析順式剪切產(chǎn)物。

2. 反式剪切實(shí)驗

c. 反式剪切體系中Target DNA可為ssDNA或帶PAM序列的dsDNA。

反式剪切體系中各組分的用量可以根據不同的實(shí)驗目的進(jìn)行調整，用量較少時(shí)可先將各組分稀釋后加入體系，enLbCas12a Nuclease可用1×HOLMES Buffer for Cas12a稀釋?zhuān)♂尯笮枇⒓词褂茫ㄈ粢♂尯蟮腃as12酶長(cháng)期保存，請使用Cas12 Dilution Buffer，#32012），crRNA、Target DNA及ssDNA Reporter可用Nuclease-free Water稀釋?zhuān)珮O低濃度的Target DNA（例如LOD實(shí)驗）建議用0.1% Tween 20稀釋并使用低吸附的離心管、吸頭等耗材。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測熒光信號，37℃反應，每30 sec采集一次熒光信號。

實(shí)驗結果

順式剪切	反式剪切

 

注意事項

1. 高活力的enLbCas12a酶crRNA的DR序列（Direct Repeat）與野生型LbCas12a（#32108）一致，可以在反應體系中用enLbCas12a酶直接替換野生型LbCas12a。
2. 不同來(lái)源的Cas12a酶，其識別靶標所需的PAM位點(diǎn)也略有不同，其中大部分Cas12a酶可識別TTN或TTTN位點(diǎn)。
3. Cas12a的順式剪切(cis-cleavage)：Cas12a在crRNA的引導下，特異性地剪切target DNA。dsDNA靶標需帶有PAM位點(diǎn)，而ssDNA靶標不依賴(lài)PAM位點(diǎn)。
4. Cas12a的反式剪切(trans-cleavage)：當target DNA存在時(shí)，Cas12a/crRNA與target DNA形成三元復合物(Cas12a/crRNA/target DNA)，同時(shí)，Cas12a被激發(fā)反式剪切活性，將反應體系中任意序列的單鏈DNA切碎。
5. 利用本產(chǎn)品的反式剪切活性進(jìn)行分子診斷實(shí)驗，可參考本公司的HOLMES體系[1]。
6. 為防止RNase污染，請保持實(shí)驗區干凈整潔，操作時(shí)需穿戴干凈的手套、口罩，實(shí)驗所用槍頭、離心管等耗材均為RNase-free。
7. Cas12a酶對熱敏感，容易失活，應全程冰上配置反應體系，并在使用后立即將酶置于-20℃保存。
8. 本產(chǎn)品僅供科研使用。