乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，可導致急性或慢性肝病，嚴重時(shí)可能會(huì )引發(fā)肝硬化、肝衰竭甚至肝癌  。HBV通過(guò)血液、母嬰傳播和性接觸進(jìn)行傳播，全球已有超過(guò)2億人感染，其中部分人發(fā)展為慢性乙型肝炎。作為病毒復制和傳染性的直接標志，HBV DNA檢測在評估病毒傳染性和抗病毒療效方面至關(guān)重要  。盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）已廣泛用于HBV DNA的檢測，但該方法也存在一些缺陷  ，例如檢測周期較長(cháng)、需要大型設備等。因此，HBV DNA檢測在提高檢測靈敏度和檢測速度等方面仍需進(jìn)一步改進(jìn)。

   本研究旨在基于RAA-CRISPR/Cas13a系統建立一種快速、靈敏且特異性良好的HBV DNA檢測方法，為臨床監測HBV的感染以及評估治療效果提供了新的思路。

實(shí)驗方法：

1.試劑與儀器：HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒（博邁德生物科技有限公司）；HBV國際標準品（英國國家生物標準與控制研究所）；瓊脂糖（索萊寶科技有限公司）；Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液和GoldenViewTM（博邁德生物科技有限公司）；TIANamp病毒DNA/RNA提取試劑盒（天根生物技術(shù)有限公司）；RAA核酸擴增試劑盒和逆轉錄-重組酶介導的等溫擴增試劑盒（眾測生物科技有限公司）；乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒（圣湘生物）；凝膠成像儀和 PCR擴增儀（美國B(niǎo)io-Rad公司）；Roche Light Cycler 480 Ⅱ實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器（瑞士羅氏公司）。

2. HBV DNA 質(zhì)粒的構建：從HBV數據庫（ https：//hbvdb.lyon.inserm.fr/HBVdb/HBVdbIndex）中下載了全長(cháng)HBV DNA序列。使用Jalview軟件比較了HBV-P區序列。比較后，選擇具有95%以上保守性的HBV DNA序列，然后以含有部分 HBV 基因組的質(zhì)粒（GenBank ID：LC456126.1 位點(diǎn)：625~758）和 pUC57 為模板構建HBV DNA陽(yáng)性質(zhì)粒，并根據保守序列設計crRNA和RAA引物。HBV保守序列篩查結果：5′-TTTCGCAAAATT CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTCAGTGGTTCGTAGGGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGTTATATGGATGATGTGGTATTGGG-3′（134 bp）。

3. CRISPR-Cas13a體系檢測HBV DNA的原理及構建：從臨床樣本的血漿中提取總HBV DNA，使用篩選出來(lái)的RAA引物對靶向的HBV DNA區域進(jìn)行RAA擴增，然后通過(guò)T7轉錄將其轉化為單鏈RNA（single strand RNA，ssRNA）。在Cas13a檢測系統中，目的ssRNA片段可以被Cas13-crRNA復合物特異性識別和結合，以觸發(fā)Cas13a活性并切割熒光報告探針釋放熒光信號，這些熒光信號可以通過(guò)熒光儀器進(jìn)行檢測并獲得熒光信號的強弱，從而反映出樣本中HBV DNA的存在。整個(gè)檢測流程大約需要1 h。

4. RAA引物和crRNA設計：從已獲得的HBV保守序列中設計3 對特異性的RAA 擴增引物和3 條 crRNA 序列（ 表1 、 2 ）。所有序列由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

5.血漿HBV DNA的提?。菏褂肨IANamp病毒DNA/RNA試劑盒從HBV陽(yáng)性患者血漿樣本中提取20 μl HBV DNA，提取的HBV DNA存放在-80 ℃冰箱備用。

6. DNA瓊脂糖電泳：將1 g瓊脂糖與100 ml 1×Tris-乙酸-乙二胺四乙酸溶液混合，加熱溶解后冷卻至50~60 ℃，然后加入10 μl GoldenView TM核酸染料。將RAA擴增產(chǎn)物上樣凝膠孔后，在170 V電泳約20 min，取出凝膠塊并放入凝膠成像儀中進(jìn)行檢查和圖像保存。

7. RAA引物和crRNA的篩選：使用3對引物分別對10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行RAA擴增，通過(guò)觀(guān)察CRISPR-Cas13a檢測的熒光信號值篩選擴增效率最高的RAA引物。10 3拷貝/μl的陽(yáng)性質(zhì)粒分別使用crRNA1、crRNA2和crRNA3進(jìn)行CRISPR-Cas13a檢測，觀(guān)察反應結束時(shí)（60 min）的熒光強度，篩選檢測效率最高的crRNA做后續實(shí)驗。

8. RAA 擴增：RAA核酸擴增試劑盒反應總體積為50 μl，其中上游引物（10 mmol/L）、下游引物（10 mmol/L）和 MgCl 2各2 μl，DNA 模板5 μl。反應條件為 37 ℃ 30 min，陰性對照為無(wú)酶無(wú)菌水。

9. CRISPR-Cas13a檢測：CRISPR-Cas13a檢測體系包括：NTP混合物（2.5 mmol/L）2 μl，LwCas13a蛋白（25 nmol/L）1 μl，RNA酶抑制劑1 μl，T7 RNA聚合酶0.5 μl，4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液（20 mmol/L）0.5 μl，MgCl 2溶液（10 mmol/L）0.25 μl，crRNA（2 μmol/L）1.5 μl，熒光報告RNA（2 nmol/L）2.5 μl，無(wú)酶無(wú)菌水（ddH 2O）10.75 μl，擴增產(chǎn)物5 μl，總體積25 μl。其中crRNA序列為：GGGGAU UUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACUACGAACCACUGAACAAAUGGCACUAGU，反應條件為 37 ℃ 1 h，陰性對照為無(wú)酶無(wú)菌水。

10.靈敏度評價(jià)：使用梯度稀釋HBV國際標準品（初始濃度為1×10 6 IU/ml，稀釋為1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0和1×10 -1 IU/ml）和HBV陽(yáng)性臨床樣本（1×10 6、1×10 5、1×10 4、1×10 3、1×10 2、1×10 1、1×10 0 IU/ml和未檢測到HBV DNA）作為檢測模板，利用已建立的CRISPR-Cas13a檢測方法在不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次以上的重復實(shí)驗，每次運行2個(gè)重復（復孔）。

11.特異性評價(jià)：為評價(jià)CRISPR-Cas13a系統檢測HBV DNA的特異性，本研究收集了其他常見(jiàn)的傳染性疾病的陽(yáng)性臨床樣本各6例（HDV、HEV和HIV），提取總RNA后，通過(guò)逆轉錄-重組酶介導的等溫擴增技術(shù)后的擴增產(chǎn)物作為檢測模板進(jìn)行交叉反應。該試驗在不同的時(shí)間點(diǎn)重復3次，每次運行2個(gè)重復。

12. qPCR檢測：使用乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒對不同病毒載量的HBV DNA陽(yáng)性患者樣本進(jìn)行qPCR檢測。反應條件：95 ℃ 5 min熱變性；95 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 45 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃自動(dòng)延伸10 min。根據Ct值判斷結果：Ct值≤35為陽(yáng)性，35<Ct值<40需重新檢測確認，Ct值無(wú)結果或>40為陰性。

13.統計學(xué)分析：應用GraphPad prism 8.0版本進(jìn)行統計學(xué)分析。正態(tài)分布的連續變量采用表示，多組間的比較采用方差分析和Tukey多重比較檢驗，2組間的比較采用配對 t檢驗。雙側檢驗， P<0.05為差異有統計學(xué)意義。

實(shí)驗結果：

一、RAA引物和crRNA篩選瓊脂糖凝膠電泳驗證了9組RAA引物（F1、F2、F3和R1、R2、R3排列組合）的可用性和擴增效率。根據亮度結果（ 圖1 ），HBV-RAA-F2、HBV-RAA-R2配對的RAA引物對表現出最佳的擴增效率（17 602.2±1 437.2），與陰性對照（5 791.64±472.8）差異有統計學(xué)意義（ t=11.04， P<0.01）。crRNA1、crRNA2和crRNA3的熒光強度分別為200.7±9.9、181.1±8.8和229.0±4.3，其中crRNA3的熒光值均高于crRNA1（ t=4.536， P<0.01）和crRNA2（ t=8.479， P<0.01），使用crRNA3用于后續檢測（ 圖2 ）。

二、靈敏度和特異性的評價(jià)使用CRISPR-Cas13a檢測60 min時(shí)，1×10 0 IU/ml的HBV DNA熒光強度（23.7±11.5）與陰性對照（1.8±0.3）差異有統計學(xué)意義（ t=47.96， P<0.01）（ 圖3A ）。反應進(jìn)行 60 min 時(shí)，HBV陽(yáng)性患者樣本的檢測相對熒光值與陰性對照的熒光值分別為196.3±7.6和4.8±1.1，差異有統計學(xué)意義（ t=13.63， P<0.01）。HIV、HEV、HDV陽(yáng)性患者樣本的檢測熒光值分別為5.4±1.5、4.9±1.6和5.0±1.0，與陰性對照的熒光值差異均無(wú)統計學(xué)意義（均 P>0.05， 圖3B ）。因此，該法檢測HBV DNA標準品的靈敏度可達到1×10 0 IU/ml。

實(shí)驗討論：

本研究將RAA與CRISPR檢測相結合建立了RAA-CRISPR 的精準檢測HBV DNA的方法，建立的檢測方法對HBV DNA陽(yáng)性標準品的檢測靈敏度為1 IU/ml；對 HBV DNA 陽(yáng)性樣本的檢測靈敏度也達到<10 IU/ml。本研究還對70 個(gè)HBV DNA陽(yáng)性臨床標本進(jìn)行檢測，結果顯示，CRISPR-Cas13a 檢測 HBV DNA的陽(yáng)性率為 100%（70/70）。與qPCR檢測系統比較，CRISPR-Cas13a系統能更快地檢測出HBV DNA陽(yáng)性患者。本研究建立的檢測方法可以快速精準地檢測HBV DNA，但也存在一些不足之處。由于 CRISPR系統的“附帶切割”具有非特異性，即切割持續且隨機，因此對HBV DNA只能進(jìn)行定性檢測，無(wú)法定量分析。本研究將RAA快速擴增與CRISPR-Cas13a相結合檢測HBV DNA，靈敏度高、特異性好。該方法還有望替代目前基于qPCR的 HBV DNA診斷方法，降低HBV檢測成本且有助于臨床HBV患者的早期干預，推動(dòng)乙型肝炎的診斷和管理，為未來(lái)HBV的POCT檢測提供方向。