載體是攜帶目的基因進(jìn)入宿主細胞的運載工具，是分子克隆技術(shù)不可或缺的重要組成部分，其中，質(zhì)粒是最常用的載體。面對日益繁多的質(zhì)粒，正確閱讀質(zhì)粒圖譜是進(jìn)行分子克隆的前提。本文將介紹如何閱讀質(zhì)粒圖譜。

 

一、質(zhì)粒的概念及分類(lèi)

1.概念

      質(zhì)粒是生物細胞內固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩定遺傳的一類(lèi)核酸分子。質(zhì)粒常見(jiàn)于原核細菌和真菌中，絕大多數的質(zhì)粒是DNA型的，少部分為RNA型。天然DNA質(zhì)粒大都具有共價(jià)、封閉、環(huán)狀的分子結構，其分子量范圍為1-300 kb。

天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數低、單一酶切位點(diǎn)少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿(mǎn)足基因工程載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進(jìn)行人工構建，所以目前使用的質(zhì)粒多為人工改造的質(zhì)粒。

理想的質(zhì)粒應滿(mǎn)足以下條件：

①復制能力：具有獨立的復制能力，在細胞中能大量繁殖，從而使目的基因大量擴增；

②表達能力：作為表達載體應能利用宿主的酶系統，表達目的基因； 

③穩定性高：細胞內能持續復制和表達；

④酶切位點(diǎn)：具有適當的限制性核酸內切酶識別和切割位點(diǎn)，即外源基因插入部位；

⑤遺傳標記：便于重組體的篩選和鑒定；

⑥分子量?。阂匀菁{較大的外源基因。

2.分類(lèi)

（1）按功能分類(lèi):克隆載體、表達載體

       克隆載體（cloning vector）：具有克隆載體的基本元件（復制起始位點(diǎn),抗性基因,多克隆位點(diǎn)等)，可以攜帶DNA片段或外源基因進(jìn)入受體細胞并克隆和擴增DNA片段或基因的載體。

表達載體（expression vector）：除了具有克隆載體的基本元件外，還有可以表達調控目的基因的元件，即轉錄翻譯所必需的DNA序列。

（2）按受體細胞的類(lèi)型分類(lèi)：原核載體、真核載體和穿梭載體

       原核載體（prokaryotic vector）：能在原核細胞中復制和表達的載體真核載體（eukaryotic vector）：能在真核細胞中復制和表達的載體

穿梭載體（shuttle vector）也叫轉移載體（transfer vector），指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）。穿梭質(zhì)粒含原核和真核生物2個(gè)復制子，以確保能夠在原核和真核兩種宿主細胞中復制與擴增，并可以在真核細胞中有效表達。

 

二、質(zhì)粒的基本元件

1.復制起點(diǎn)（Origin of replication，ori）

       DNA復制起始位點(diǎn)ori負責控制質(zhì)粒復制的起始，原核生物DNA分子中只有一個(gè)復制起始位點(diǎn)；而真核生物DNA分子有多個(gè)復制起始位點(diǎn)。若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori，表示質(zhì)粒是原核克隆及表達質(zhì)粒；而圖譜上有兩個(gè)ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒，既可以在原核也可以在真核中復制。

2.啟動(dòng)子（promoter, P）

       與RNA聚合酶特異性結合，促進(jìn)基因轉錄的DNA序列。含有RNA 聚合酶特異性結合和轉錄起始所需的保守序列。

真核細胞含有三類(lèi)RNA聚合酶，因此真核啟動(dòng)子還分為I、II、III類(lèi)啟動(dòng)。常見(jiàn)表達或者過(guò)表達都是II類(lèi)啟動(dòng)子，而III類(lèi)啟動(dòng)子如U6、H1，啟動(dòng)小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于構建shRNA和sgRNA載體進(jìn)行敲低或敲除操作。

Ⅱ型啟動(dòng)子在使用特點(diǎn)上又可分為三大類(lèi)：組成型啟動(dòng)子（廣泛性啟動(dòng)子）、組織特異性啟動(dòng)子、誘導型啟動(dòng)子。

此外，不同物種的表達體系具有不同的啟動(dòng)子，啟動(dòng)子啟動(dòng)基因表達也有強弱之分，因此我們需要根據自己的需求選擇含有相應啟動(dòng)子的質(zhì)粒。關(guān)于啟動(dòng)子的詳細介紹見(jiàn)往期推文。

3.增強子（enhancer）：增強目的基因轉錄

4.篩選標記（selectable markers）

       多為抗生素抗性基因，方便后續篩選陽(yáng)性克隆。原核細胞篩選標記常用的是氨芐青霉素/氨芐西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四環(huán)素Tet等；真核細胞篩選標記用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。質(zhì)粒圖譜中用抗生素縮寫(xiě)+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

抗生素作用機制及用途見(jiàn)下表

 

5. 多克隆位點(diǎn)（multiple cloning sites，MCS）

       外源 DNA的插入位點(diǎn)，通常位于啟動(dòng)子的下游，具有多個(gè)核酸內切酶的酶切位點(diǎn)，可通過(guò)酶切/連接方式將外源 DNA 插入到質(zhì)粒。質(zhì)粒圖譜中有些酶切位點(diǎn)右上角標注了“*”，代表可能并不僅僅存在單一限制位點(diǎn)，所以一般不選用標有星號的酶切位點(diǎn)。

6.轉錄終止信號（polyA  signal）

       轉錄到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA會(huì )接上polyA并轉錄終止。常見(jiàn)的轉錄終止信號位SV40 polyA，簡(jiǎn)寫(xiě)為SV40 pA

7. 熒光基因

      可以用激光激發(fā)產(chǎn)生熒光的蛋白，一般會(huì )獨立表達或和目的基因融合表達的方式被設計在質(zhì)粒上，起到示蹤、陽(yáng)性檢測、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白標簽

      蛋白標簽大多為較短的短肽，一般融合表達在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了標簽，在缺乏針對目的蛋白的抗體時(shí)就可以很方便的對目的蛋白做檢測了

9.其他調控元件

WPRE：來(lái)自土撥鼠肝炎病毒的轉錄后調節元件，放置在目的基因的上游，能加強目的基因的表達。

cPPT：來(lái)自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數，提高病毒滴度。

 

三、如何閱讀質(zhì)粒圖譜

以pLKO.1-Puro質(zhì)粒（常用于構建shRNA載體）為例，對質(zhì)粒圖譜進(jìn)行解讀

 

1.首先看箭頭方向

      質(zhì)粒圖譜上都會(huì )存在箭頭，箭頭方向可以代表轉錄方向如圖中U6、hPGK、AmpR等啟動(dòng)子（白色箭頭）的方向，也可以代表復制方向，即 ori（黃色箭頭）的箭頭方向。設計引物及插入目的基因的方向是根據轉錄方向（啟動(dòng)子方向）來(lái)定的。由于質(zhì)粒是環(huán)狀雙鏈DNA，箭頭可有順時(shí)針和逆時(shí)針?lè )较?，代表兩條DNA鏈，它的啟動(dòng)子在其中一條鏈上，而它的某些基因在另一條鏈上。

2.看ori鑒別質(zhì)粒類(lèi)型

      前文提到，若質(zhì)粒圖譜上只有一個(gè)ori，表示質(zhì)粒是原核克隆及表達質(zhì)粒；而圖譜上有3個(gè)ori，則表示該質(zhì)粒是穿梭質(zhì)粒。因此該質(zhì)粒為穿梭質(zhì)粒。

 

 

 

3.看啟動(dòng)子確定質(zhì)粒的作用

       該質(zhì)粒圖譜中有7個(gè)啟動(dòng)子（白色箭頭），U6啟動(dòng)子可用于構建shRNA和sgRNA載體；hPGK和AmpR啟動(dòng)子啟動(dòng)Puro和Amp抗性基因的表達，可用于篩選陽(yáng)性克隆。T3和T7啟動(dòng)子分別是噬菌體T3和T7 RNA聚合酶的啟動(dòng)子，lac啟動(dòng)子是大腸桿菌乳糖操縱子的啟動(dòng)子，RSV啟動(dòng)子是rous肉瘤病毒增強子/啟動(dòng)子。

 

4.看篩選標記/抗性基因

       圖中有AmpR（氨芐西林抗性基因）和PuroR（嘌呤霉素抗性基因），AmpR用于原核細胞如大腸桿菌篩選，PuroR用于真核細胞如腫瘤細胞的篩選。當大腸桿菌和腫瘤細胞中不存在該質(zhì)粒時(shí)就無(wú)法表達抗性基因，因此應用氨芐西林或嘌呤霉素可以篩選出陽(yáng)性克隆。各抗生素作用機制與用途見(jiàn)前文。

 

5.看多克隆位點(diǎn)

       該質(zhì)粒圖譜中圓圈外圍的黑體字母代表酶切位點(diǎn)，可用于插入外源基因。pLKO.1-Puro質(zhì)粒常用于構建shRNA載體，插入的shRNA靶序列位于U6啟動(dòng)子下游且緊鄰U6啟動(dòng)子。針對該質(zhì)粒，我們常選用AgeI和EcoRI這兩個(gè)酶切位點(diǎn)引入外源shRNA靶序列。

 

6.看轉錄終止信號

       質(zhì)粒圖譜中pA或者poly A代表轉錄終止信號。

 

7.熒光標記

      有的質(zhì)粒帶有熒光標記，用于直觀(guān)判斷質(zhì)粒是否轉染成功。如下圖所示，與pLKO.1-Puro相比，pLKO.1-EGFP-Puro主要不同在于多了CMV啟動(dòng)子/增強子和EGFP序列（箭頭表示），CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)EGFP（增強的綠色熒光蛋白）的表達。其余部分與pLKO.1-Puro相差不大。

 

 

8.其他

        回到pLKO.1-Puro質(zhì)粒，長(cháng)末端重復序列（long terminal repeats，LTR）存在于反轉錄病毒基因組的兩端，即5’ LTR和3’LTR，不編碼蛋白質(zhì)，但含有啟動(dòng)子，增強子等調控元件。

cPPT來(lái)自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因組的拷貝數，提高病毒滴度。

M13 fwd和M13 rev是M13上下游通用引物，可用于后續測序。

CAP binding site（CAP結合位點(diǎn)）在cAMP存在時(shí)激活轉錄。

HIV-1Ψ是人類(lèi)免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的包裝信號。 

RRE（Rev response element）允許Rev依賴(lài)的mRNA從細胞核輸出到細胞質(zhì)。

gp41 peptide介導HIV與CD4細胞融合，從而HIV進(jìn)入細胞內。

 

想必通過(guò)上面的講解，大家對質(zhì)粒圖譜的閱讀應該有大致的了解，那就找幾張質(zhì)粒圖譜練習吧?？稍?/span>addgene網(wǎng)站（https://www.addgene.org/）搜索想要的質(zhì)粒。如圖：

 

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M0891	Kanamycin Sulfate 硫酸卡那霉素	100g
H5570	Tetracyclin HCl 四環(huán)素鹽酸鹽（USP）	25g
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