測定意義：

Hephaestin (HP)作為銅藍蛋白的同系物,是近年來(lái)發(fā)現的鐵轉運蛋白亞鐵氧化酶，HP屬亞鐵氧化酶家族成員,具有亞鐵氧化酶的活性,參與體內鐵代謝。HP的表達可受鐵、銅及鋅等金屬離子的調節。HP催化Fe²⁺氧化生成Fe³⁺，在介導鐵的跨膜轉運中有重要作用。

測定原理：

HP催化Fe²⁺氧化為Fe³⁺，Fe²⁺和ferrozine反應顯色，在560 nm下有特征吸光值。通過(guò)測定Fe²⁺的減少速率可測得亞鐵氧化酶的活性。

試劑組成和配制：

需自備儀器和用品：

酶標儀、臺式離心機、可調式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

按照組織質(zhì)量（g）：水（ml)為1：5~10的比例（建議稱(chēng)取約0.1g組織，加入1ml蒸餾水），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、分光光度計預熱30min以上，調節波長(cháng)至560nm，蒸餾水調零。

2、在96孔板中加入下列試劑

混勻，立即測定A對照和A測定，ΔA=A對照-A測定。(每個(gè)測定管需設一個(gè)對照管)

HP活性計算:

標準曲線(xiàn)：y = 8.2135x - 0.0006，R2 = 0.9998；(x為標準品濃度，μmol/ml；y為吸光值ΔA)

（1）按樣本質(zhì)量計算

單位定義：每g樣本每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。

HP（nmol/min/g 鮮重）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷(W× V樣÷V樣總)× 1000= 40.58×（△A+0.0006）÷W

（2）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg蛋白每分鐘氧化1nmol Fe2+定義為一個(gè)酶活力單位。

HP（nmol/min/mg prot）=（△A+0.0006）÷ 8.2135×V總÷T ÷（Cpr×V樣）  = 40.58×（△A+0.0006）÷Cpr

V總：反應體系體積，0.1 ml；V樣：加入樣本體積0.01 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時(shí)間，30min；W：樣品質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/ml；1000，μmol到nmol的轉換系數。