隨著(zhù)生命科學(xué)的不斷進(jìn)步，mRNA作為藥物被應用到疾病治療、疫苗等領(lǐng)域。從1990年體外合成的mRNA第一次在細胞內表達，到2020年的mRNA疫苗在對抗新冠疫苗發(fā)揮重要作用。以mRNA為基礎的治療方式已經(jīng)在醫藥領(lǐng)域引起了一場(chǎng)革命。
mRNA（Messenger RNA、信使RNA）是將DNA中的基因信息傳遞到蛋白的中間信使。mRNA疫苗治療（見(jiàn)下圖）是指在體外合成mRNA，將其導入體內，mRNA進(jìn)入細胞后翻譯表達出抗原蛋白，抗原刺激體內免疫系統，激活體液免疫和細胞免疫，當機體再次接觸同種抗原（細胞/病毒），可產(chǎn)生快速免疫應答反應，自我保護。

       mRNA疫苗具有研發(fā)速度快、靈活、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、平臺化、容易擴充產(chǎn)能，可以用于精準化和個(gè)性化治療，一次可呈遞多種抗原等優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗屬于第三代疫苗技術(shù)（見(jiàn)下圖），相比于傳統疫苗需要通過(guò)將病原微生物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)人工滅毒﹑減活﹑基因工程的方法制成的繁雜工序，第三代疫苗特異性更強，有效性更高，并且研發(fā)周期較快。它的結構簡(jiǎn)單、可人工批量合成，并且可以在研發(fā)階段進(jìn)行高通量篩選，大大節省研發(fā)時(shí)間。而且相較于DNA疫苗，mRNA疫苗沒(méi)有導入外源基因的遺傳風(fēng)險，起效更快，效果更強。

mRNA疫苗相對于其他疫苗的優(yōu)勢  圖片引用于網(wǎng)絡(luò )

       mRNA疫苗具有工藝通用性好，研發(fā)速度快，能夠活化細胞免疫，刺激效果好，遞送效果好等特性。高的mRNA產(chǎn)量需要高效的mRNA體外合成方法，大規模生產(chǎn)選擇T7 RNA聚合酶體外轉錄。增強mRNA的穩定性，降低免疫原性并提升翻譯效率，最有效的解決方案是：使用加帽酶對mRNA進(jìn)行加帽，使其在細胞內外穩定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖體識別，啟動(dòng)翻譯程序。

      近岸蛋白質(zhì)提供一系列mRNA體外合成酶及試劑，解決mRNA疫苗的關(guān)鍵痛點(diǎn)。所有產(chǎn)品均采用藥用規格原輔料生產(chǎn)，嚴格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見(jiàn)病原體污染，符合GMP規范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規程，保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
GMP級mRNA體外合成及修飾原料，animal-free，ampicillin-free
產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系，符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求
經(jīng)過(guò)臨床使用驗證，單批次產(chǎn)能千萬(wàn)人份，年產(chǎn)能50億人份
       
mRNA疫苗體外合成關(guān)鍵步驟及相關(guān)產(chǎn)品：

1、生成模板-質(zhì)粒線(xiàn)性化 相關(guān)產(chǎn)品：Bsa I，GMP Grade（貨號：GMP-RE026）
        此步將構建好的質(zhì)粒酶切，處理成線(xiàn)性化雙鏈DNA模板，用于下一步mRNA合成。
        限制性?xún)惹忻窧sa I 特異性識別雙鏈DNA中位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，可將模板質(zhì)粒酶切線(xiàn)性化，作為mRNA體外合成模板；
        酶切位點(diǎn)：

產(chǎn)品特點(diǎn)：
        強特異性
        受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷
        受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響
        不受Dam甲基化影響

2、mRNA體外合成  相關(guān)產(chǎn)品：T7 RNA Polymerase, GMP Grade (貨號：GMP-E121)
       此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）是高度特異識別T7啟動(dòng)子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動(dòng)子下游的單鏈DNA互補的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉錄mRNA的關(guān)鍵酶。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
高度特異識別T7啟動(dòng)子
20ul反應體系，產(chǎn)量可達150ug
可對低至1ng模板進(jìn)行有效轉錄
合成長(cháng)度可達15k

體外轉錄產(chǎn)生的mRNA，Qsep1結果顯示，純度高，均一性好。

3、mRNA轉錄后修飾：加帽加尾
此步對mRNA進(jìn)行修飾，合成功能完整的mRNA。

完整mRNA結構
3.1、mRNA加帽(Cap0)   相關(guān)產(chǎn)品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號：GMP-M062)        
      此步與3.2同時(shí)進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結構。
在真核生物中，轉錄后的mRNA必需經(jīng)過(guò)一系列修飾才能形成完整的結構，即在5'端形成一個(gè)帽子結構（Cap1），3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。
      Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）用于給體外轉錄合成的mRNA催化加上帽子結構（Cap0），顯著(zhù)改善mRNA的穩定性和翻譯能力，使mRNA可在細胞內表達蛋白，避免核酸外切酶等的降解破壞。
      mRNA的帽結構是由一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷通過(guò)一個(gè)5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結構由相鄰的RNA鏈通過(guò)三種酶的依次反應形成。進(jìn)一步形成cap-1結構需要2-O甲基轉移酶（Cat. No: GMP-M072, Novoprotein）參與，該修飾可以降低RNA在體內引起的細胞先天免疫反應。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
高效完成mRNA加帽Cap0   
提高mRNA的穩定性，防止被RNA酶降解                                                           
提高mRNA的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量

3.2、mRNA加帽(Cap1)  相關(guān)產(chǎn)品：mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (貨號：GMP-M072)
       此步與3.1同時(shí)進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結構的基礎上，再將Cap0轉化為Cap1結構。
       真核生物中，mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個(gè)特殊結構，即帽子結構，3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。已知Cap1結構存在于所有真核生物mRNA，在穩定mRNA結構和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明，體外轉錄修飾得到的Cap1結構mRNA更不容易被免疫系統的RNA感受器（RIG-I）識別，因此免疫刺激更低。
       mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas （2′-O-甲基轉移酶）可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體， 在 RNA 5′末端緊鄰帽結構（Cap 0）的第一個(gè)核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團，形成帶有 Cap 1 結構的 mRNA。Cap1 結構能增強 mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉染后 mRNA 編碼的蛋白表達水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會(huì )作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結構（m7GpppN）的 RNA 可通過(guò) Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）來(lái)制備。

產(chǎn)品特點(diǎn)：
使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子
提高 RNA 的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量
進(jìn)一步降低免疫原性

完整mRNA在細胞內表達GFP蛋白，加帽酶與帽類(lèi)似物對比

3.3、mRNA加尾(PolyA)  相關(guān)產(chǎn)品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號：GMP-M012)
      此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。
      真核生物中，mRNA的轉錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個(gè)特殊結構，即帽子結構，3’端形成PolyA尾結構。這些結構與mRNA的穩定、轉運和翻譯密切相關(guān)。Poly A與成熟mRNA的穩定性、翻譯起始以及出核運輸有關(guān)，體內轉錄后修飾中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。
體外轉錄RNA過(guò)程中，E. coli Poly (A) Polymerase（加尾酶） 不依賴(lài)模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端，即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個(gè) A 堿基。最大程度還原體內加尾過(guò)程。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
穩定mRNA的存在形式
引導轉錄終止
提高RNA在真核細胞中的翻譯效率

4、其他相關(guān)產(chǎn)品
4.1、防止mRNA降解  相關(guān)產(chǎn)品：RNase inhibitor, GMP Grade (貨號：GMP-E125)
在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。
RNase Inhibitor可與RNase  A形成1：1復合體，對RNase 有極強非競爭性抑制，保護mRNA轉錄后不被降解
產(chǎn)品特點(diǎn)：
強抑制RNase活性
穩定性強

4.2、降解模板DNA  相關(guān)產(chǎn)品：DNase I, GMP Grade (貨號：GMP-E127)
        在流程2 RNA合成結束后，去除模板DNA。
DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機分解。

DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留

4.3、增加mRNA產(chǎn)量  相關(guān)產(chǎn)品：Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (貨號：GMP-M036)
        在流程2 RNA合成過(guò)程中加入無(wú)機焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量。
        無(wú)機焦磷酸酶PPase（Pyrophosphatase, Inorganic）可催化無(wú)機焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽（P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2），一方面可去除無(wú)機焦磷酸鹽對反應體系的抑制，另一方面為反應提供熱力學(xué)動(dòng)力，促進(jìn)產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質(zhì)的生物合成中，是一種良好的輔劑，在mRNA疫苗體外大規模合成中加入可顯著(zhù)提高產(chǎn)量。

轉載來(lái)源：RNAScript
原文：近岸蛋白質(zhì)網(wǎng)站 Fr. https://www.novoprotein.com.cn/Cn/product/inproducts/id/536/catid/38.html