產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以螢光素(luciferin)為底物來(lái)檢測螢火蟲(chóng)螢光素酶(Firefly luciferase)，后以腸腔素(coelenterazine)為底物來(lái)檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase)，并且在后續加入海腎螢光素酶底物時(shí)，同時(shí)加入抑制螢火蟲(chóng)熒光素酶催化luciferin發(fā)光的物質(zhì)，使后續檢測僅僅檢測到海腎螢光素酶的活性，實(shí)現雙螢光素酶報告基因檢測。

螢火蟲(chóng)螢光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白，在A(yíng)TP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過(guò)程中，會(huì )發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的過(guò)程中也會(huì )發(fā)出生物螢光。生物螢光可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進(jìn)行測定。本試劑盒的檢測原理參考圖1.

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒為檢測基因的表達量提供有效的手段，在DLR 檢測中，螢火蟲(chóng)螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性可在單個(gè)樣品中依次檢測。先以螢光素（Luciferin）為底物來(lái)檢測螢火蟲(chóng)螢光素酶的活性，然后加入抑制螢火蟲(chóng)螢光素酶催化的物質(zhì)，同時(shí)加入腔腸素（Coelenterazine）檢測海腎螢光素酶的活性，實(shí)現雙螢光素酶報告基因檢測。通過(guò)螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達。通常把感興趣基因的轉錄調控元件或 5' 啟動(dòng)子區克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區克隆在Luciferase 的下游，構建成報告基因（Reporter gene）質(zhì)粒，然后轉染細胞，用適當藥物等處理細胞后裂解細胞，通過(guò)檢測螢光素酶活性的高低來(lái)判斷藥物處理等對目的基因的轉錄調控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測轉染效率的內參，以消除細胞數量和轉染效率的差異。

螢火蟲(chóng)螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強發(fā)光波長(cháng)為560nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強發(fā)光波長(cháng)為465nm。

本試劑盒的光信號可以通過(guò)化學(xué)發(fā)光儀、酶標儀或液閃測定儀進(jìn)行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無(wú)細胞內源活性干擾等特點(diǎn)。

Figure 1. Bioluminescent reactions catalyzed by firefly luciferase  and Renilla luciferase.

試劑盒組份：

保存條件：

最好在-80℃保存。將 C 組分溶解到 B 組分后，該混合液不可反復凍融，建議進(jìn)行小批量分裝，并于-20℃(最長(cháng)可儲存 1 個(gè)月)或-80℃（最長(cháng)可儲存 1 年）條件下儲存。Renilla Luciferase Assay solution（D+E）應新鮮配制，當天使用。

使用方法：

1. 裂解細胞：

將報告基因細胞裂解液充分混勻后，按如下方式加入報告基因細胞裂解液，充分裂解細胞。

1.1)對于貼壁細胞：吸盡細胞培養液后，參考下表加入適量的報告基因細胞裂解液；對于懸浮細胞：離心去上清后，參考下表加入適量報告基因細胞裂解液。

注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h，-70℃可長(cháng)期存放(裂解產(chǎn)物不能反復凍融);

注：如果螢光素酶的表達水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小為100微升。
      1.2) 充分裂解后，10,000-15,000g離心3-5分鐘，取上清用于測定。
注：細胞裂解后可以立即測定螢光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達到室溫后再進(jìn)行測定。

2. Preparation of Firefly Working Solution

2.1) 將所有組分恢復至室溫。

2.2) 配置10 mg/mL D-luciferin儲存液。2mg組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以?xún)Υ?/span>6個(gè)月反復凍融5次。

2.3）工作液配置 ：用組分 B 按照1:50稀釋以上D-luciferin儲存液，配制成 0.2 mg/mL 的螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液。

注：螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液不能反復凍融超過(guò)5次，若單次實(shí)驗用量較少，建議按單次使用量分裝成小規格。

3. Preparation of Renilla Working Solution

3.1)  將所有組分恢復至室溫。

3.2) 配置2 mg/mL Coelenterazine儲存液。400ug組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以?xún)Υ?/span>3個(gè)月反復凍融5次。

3.3）工作液配置 ：用組分 D 按照1:50稀釋以上coelenterazine儲存液，配制成 0.04 mg/mL 的1x coelenterazine工作液。

注：1×Coelenterazine工作液現配現用，配置后在3小時(shí)內使用。

4. 化學(xué)發(fā)光值檢測

4.1）按儀器操作說(shuō)明書(shū)開(kāi)啟具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的儀器如酶標儀。

4.2）每個(gè)樣品測定時(shí)，取樣品 20-100uL(如果樣品量足夠，請加入 100 μL；如果樣品量不足可適當減少用量，但檢測孔用量需保持一致）。1× Lysis Buffer 為空白對照。

4.3）加入 100uL螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測液，用槍吹打均勻或用其它適當方式混勻后測定 RLU（relative light unit）值。

注：由于該發(fā)光為瞬時(shí)發(fā)光，建議加入螢火蟲(chóng)螢光素酶工作液后，立即進(jìn)行檢測。

4.4）加入 100uL 1× Coelenterazine 工作液，用槍吹打均勻或用其它適當方式混勻后測定 RLU（relative light unit）值。

4.5）在以海腎螢光素酶為內參的情況下，用螢火蟲(chóng)螢光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎螢光素酶測定得到的 RLU 值。根據得到的比值來(lái)比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲(chóng)螢光素酶為內參，也可以進(jìn)行類(lèi)似計算。

注意事項:

1)為取得最佳測定效果，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時(shí)， 樣品和測定試劑混合后到測定前的時(shí)間應盡量控制一致；使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標儀時(shí)，宜先把樣品全部加好，然后統一加入螢火蟲(chóng)螢光素酶檢測試劑。

2) 由于溫度對酶反應有影響，所以測定時(shí)，樣品和試劑均需達到室溫后再進(jìn)行測定。

3 本公司所有產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員用于生命科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

4) 本公司所有產(chǎn)品必須由合格專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員操作同時(shí)佩戴口罩/手套/實(shí)驗服并遵守生物實(shí)驗室安全操作規程！